当抗日战争进入相持阶段后，蒋介石又采取了消极抗日的政策，不断制造反共摩擦。
1940年11月14日，国民党军令部拟定了《黄河以南剿灭共匪作战计划》，规定第三、第五战区的国民党军主力避免与日寇作战，集中力量分两步迫使八路军、新四军于1941年2月底以前撤至黄河以北。12月3日，国民党军令部长徐永昌又策划了消灭皖南新四军的作战部署，规定皖南新四军不得由镇江北渡，只准由江南原地北渡，或由国民党另行规定北渡路线。国民党这样做，无非是为了借机消灭皖南新四军。根据上述“计划”和“部署”，第三战区司令长官顾祝同在皖南集结了7个师和1个旅，共8万多人，任命上官云相为总指挥，设置了袋形阵地准备歼灭北渡的皖南新四军。
中共中央为了顾全大局，同意了将皖南新四军北移的要求，电令项英加紧北移的工作，并及时通报了国民党在皖南集结重兵的情况。
1941年1月4日，皖南新四军冒雨踏上了北上的征途。当时全军共约9000余人，编成3个纵队。6日拂晓，新四军老3团的一个便衣班在云岭脚下与国民党第40师第120团的一个搜索连遭遇，发生激战。
事变的枪声打响后，国民党军队凭借优势兵力步步紧逼，高岭、铜山、高坦等战区炮火纷飞。6日下午，新四军军部召开紧急会议，决定会攻星潭，然后冲出包围圈。正当新四军在7日晚攻克星潭，准备乘胜追击，扩大战果时，项英突然下令将部队撤回，将刚用血肉夺来的星潭，又还给敌军。12日下午，在形势万分紧急的情况下，新四军召开了团以上干部紧急会议。叶挺军长决定立即分散突围，确定了突围后的汇合地点。13日凌晨，新四军军部首长率精干人员分两路突围。叶挺、饶漱石为一路;项英、袁国平、周子昆为一路。这时候，上官云相又发起了第三次总攻击，为了保存力量，叶挺军长决定深入敌营，与顾祝同谈判，结果被卑鄙地扣留。项英带领的一路在大观山中隐蔽了一个多月，后来，项英的副官刘厚总叛变，打死了项英、周子昆，向国民党邀功去了。在皖南事变中，皖南新四军9000余人与国民党军8万之众英勇拼杀了7昼夜，除约2000余人突围外，3000余人壮烈牺牲，3600余人被俘或失散。
事变后，蒋介石公然宣布新四军为“叛军”，下令取消新四军番号，将叶挺交付军事法庭“审判”。为了回击国民党反动派，周恩来愤然在《新华日报》题写了“为江南死国难者志哀”的题词和“千古奇冤，江南一叶，同室操戈，相煎何急”的挽词，有力地揭露了国民党反动派的罪行。几天后，中共中央军委发布重建新四军的命令，任命陈毅为代军长，刘少奇为政治委员，全军扩编为7个师。
皖南事变引起国内外舆论的强烈反应，美、苏等盟国纷纷指责蒋介石的所作所为，国民党内部的部分将领也极为不满，全国人民更是同声谴责，蒋介石在政治上陷入了空前的孤立。
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